BIOKIMIA : Sifat-Sifat Reaksi Karbohidrat (Uji Monosakarida)

1. Sifat Mereduksi

a. Uji Benedict dan Fehling (Dalam Larutan Alkali)

Gula dapat bertindak sebagai pereduksi pada beberapa senyawa seperti Cu (tembaga), Bi (bismut), Fe(CN)6. Hal tersebut terkait adanya gugus karbonil bebas pada gula (aldehid dan keton) yang dapat berubah menjadi bentuk enol reaktif dan sangat mudah mengalami oksidasi di dalam larutan alkali. Berdasarkan prinsip dasar tersebut maka jenis reagen yang sering digunakan adalah :

• Larutan benedict (berisi CuS04, Na Sitrat dan N2C03).
• Larutan Fehling (berisi CuS04, K-Na-Tartrat dan KOH).

Dalam proses-nya Na-sitrat dan K-Na-Tartrat dapat mencegah terbentuknya endapan Cu(OH)2 atau Cu-karbonat Alkali yang berguna untuk merubah gula menjadi enol yang reaktif dan selanjutnya dapat mereduksi Cu++ dari senyawa kompleks dengan sitrat atau tartrat menjadi Cu+. Kemudian Cu+ bersama OH akan membentuk CuOH yang bewarna kuning dan dengan pemanasan akan berubah menjadi Cu2O yang bewarna merah bata.

Percobaan Benedict:

1. 5 ml reagen benedict dituangkan ke dalam tabung reaksi
2. Ditambahkan 0,5 ml (setara dengan 8 tetes) larutan glukosa
3. Panaskan dalam penangas air selama 5 menit atau dapat pula dipanaskan secara langsung selama 1 menit
4. Amati perubahan warna.
5. Lakukan hal yang sama terhadap fruktosa, arabinosa, maltosa, laktosa dan sukrosa.

Percobaan Fehling:

1. 5 ml Fehling A dan 5 ml Fehling B dicampurkan
2. Ditambahkan 2,5 larutan glukosa, campur hingga rata
3. Panaskan hingga mendidih
4. Perhatikan timbulnya endapan bewarna kuning atau kuning merah
5. Catatan: 

• Larutan Fehling A dibuat dengan melarutkan 35 gram kristal cuSO4 dalam 1000 ml aquades.
• Larutan Fehling B dibuat dengan melarutkan 173 gram garam Seignette dan 50 gram Na-hidroxida  dalam 1000 ml aquades.

b. Uji Barfoed (Dalam Larutan Asam)

Uji Barfoed bertujuan untuk membedakan monosakarida dan disakarida. Seperti pada uji benedict, uji barfoed juga didasarkan pada sifat pereduksi gula. Hanya saja pada uji ini, karbohidrat direduksi pada suasana asam. Pereaksi yang digunakan pada uji ini adalah larutan Cu-asetat yang ditambah asam laktat. 

Dalam suasana asam, polisakarida atau disakarida akan mengalami hidrolisis parsial menjadi sebagian kecil monomernya. Sehingga hal tersebut menjadi dasar untuk membedakan monosakarida, disakarida dan polisakarida. 

Monomer gula yang terbentuk dari proses hidrolisis parsial akan mengalami reaksi dengan fosfomolibdat. Jika senyawa yang dihasilkan bewarna biru maka hasil tersebut positif. Hanya saja jika dibandingkan dengan monosakarida, polisakarida memiliki kadar monosakarida yang lebih kecil, sehingga intensitas warna biru yang dihasilkan lebih rendah. Sedangkan pada disakarida, hasil positif selain ditunjukkan warna biru juga ditunjukkan dengan terbentuknya endapan merah bata jika dididihkan cukup lama. Endapan merah bata tersebut adalah Cu2O (kupro oksida) yang merupakan hasil reduksi ion Cu2+ dari pereaksi Barfoed (dalam suasana asam). Reduksi tersebut lebih cepat terjadi pada monosakarida dibandingkan disakarida. 

Percobaan:

1. 1 ml larutan Barfoed dimasukkan ke dalam tabung reaksi
2. Ditambahkan 1 ml larutan uji
3. Panaskan dalam penangas air selama 3 menit
4. Tabung reaksi tersebut selanjutnya didinginkan dengan air mengalir selama 2 menit
5. Ditambahkan 1 ml reagen warna fosfomolibdat. Warna biru yang terbentuk menunjukkan adanya monosakarida atau disakarida.

2. Pengaruh Asam

a. Uji Molisch

Uji Molisch merupakan uji kualitatif untuk mengetahui adanya karbohidrat baik dalam bentuk bebas maupun terikat. Uji Molisch didasarkan oleh reaksi dehidrasi karbohidrat oleh asam pekat (asam sulfat/H2SO4) yang membentuk cincin furfural atau turunan-nya bewarna ungu. Reaksi positif ditunjukkan dengan adanya cincin bewarna ungu di permukaan antara lapisan sampel uji dan asam. 

Heksosa dengan asam pekat melalui pemanasan akan membentuk hidroksimetil furfural, sedangkan pentosa akan membentuk furfural. H2SO4 merupakan salah satu asam pekat yang dapat digunakan dalam uji Molisch, namun dapat juga diganti dengan jenis asam pekat lainnya. Asam pekat tersebut berfungsi sebagai penghidrolisis ikatan pada sakarida untuk menghasilkan furfural. Furfural tersebut kemudian bereaksi dengan reagent Molisch yang selanjutnya akan mengalami kondensasi 4-hidroksimetilfurfural dengan α-naphthol membentuk cincin yang berwarna ungu.

Percobaan:

1. 2 ml larutan glukosa dituangkan ke dalam tabung reaksi
2. Ditambahkan 2 tetes reagen Molisch (10% α-naphthol)
3. Ditambahkan 2 ml H2SO4 (asam sulfat) melalui dinding tabung hingga terbentuk lapisan di bawah campuran
4. Terbentuknya cincing ungu menunjukkan adanya karbohidrat.

b. Uji Seliwanof

Uji Seliwanof digunakan untuk membedakan gula aldosa dan ketosa, berdasarkan gugus keton dan aldehid-nya. Jika gula tersebut memiliki gugus keton maka termasuk ke dalam ketosa dan sebaliknya jika memliki gugus aldehid maka termasuk gula aldosa.

Pada prinsip dasarnya, uji Seliwanof sama dengan uji Molisch yakni pembentukan cincin furfural, karena adanya pemanasan dan pengaruh suasana asam. Kondensasi 3-hidroksimetil furfural dengan resorsinol (1,3 dihidroksi benzen) yang akan membentuk senyawa bewarna merah. Reaksi tersebut khas untuk levulosa, seperti fruktosa.

Reagen Seliwanof terdiri dari resorsinol dan asam klorida (HCL) yang bersifat pekat, yang nantinya akan menghidrolisis polisakarida dan oligosakarida  menjadi gula sederhana. Ketosa yang terhidrasi akan bereaksi resorsinol menghasilkan senyawa bewarna merah bata tua, sedangkan aldosa dapat sedikit beraksi dan menghasilkan senyawa bewarna merah muda. 

Fruktosa dan sukrosa memberikan hasil positif. Sukrosa menunjukkan hasil positif karena termasuk disakarida yang terdiri dari fruktosa dan glukosa.

Percobaan:

1. 5 ml reagen Seliwanof (0,5% resorsinol dalam HCL 5N) dituangkan ke dalam tabung reaksi.
2. Ditambahkan 1 ml larutan uji/sampel
3. Didihkan selama 30 detik dalam penangas air atau pemanasan langsung.
4. Amati perubahan warna yang terbentuk

3. Pengaruh Alkali dengan Uji Benedict

Dalam larutan alkali, ketosa dan aldosa akan menjadi enol yang reaktif.Bentuk enol glukosa, fruktosa dan manosa adalah sama. Apabila larutan alkali salah satu gula didiamkan akan diperoleh campuran glukosa, fruktosa dan manosa. 

Uji Benedict yang pada percobaan alkali bersifat spesifik pada karbohidrat yang mempunyai gugus karbonil bebas, yaitu semua monosakarida dan disakarida (kecuali sukrosa dan trehalosa). Uji benedict tersebut dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya gugus reduksi pada glukosa, sukrosa dan maltodekstrin. Gugus reduksi tersebut mempunyai kemampuan untuk mereduksi terkait kandungan gugus reduktif yang mempunyai batasan yaitu gugus -OH bebas yang terikat pada atom C hemiasetal.  Gula reduksi dengan larutan Benedict (campuran garam kuprisulfat, natrium sitrat, natrium karbonat) akan mengalami reaksi reduksi-oksidasi dan menghasilkan endapan berwarna merah bata dari kuprooksida. Jadi kriteria untuk reaksi positif adalah terbentuknya endapan kuprooksida dengan warna merah bata.

Percobaan:

1. 2 ml larutan glukosa dituangkan ke dalam tabung reaksi
2. Ditambahkan sedikit Na-karbonat anhidrit
3. Gojog dan dibagi ke dalam 2 tabung
4. Tabung pertama dididihkan selama 1 menit kemudia didinginkan dalam air mengalir atau direndam. 
5. Tabung kedua dibiarkan
6. Tambahkan 1 ml reagen Benedict ke dalam kedua tabung dan biarkan tanpa pemanasan.
7. Amati perubahan yang terjadi

4. Pembentukan Osazon (Uji Fenilhidrasin)

Osazon merupakan kristal kuning derivat gula yang bersifat tidak larut air dan memiliki bentuk khas disetiap jenis gula, sehingga dapat menjadi dasar identifikasi. Osazon diperoleh dari monosakarida dan beberapa disakarida yang mengandung gugus aldosa dan ketosa melalui penambahan fenilhidrasin yang membentuk fenilhidrazon. Selanjutnya osazon itu sendiri akan terbentuk karena fenilhidrazon mengalami penambahan fenilhdrasin secara berlebih. Secara lengkap reaksi pembentukan osazon dapat dilihat sebagai berikut:

Aldosa + fenilhidrazin     -->  fenilhidrazon

Fenilhidrazon + 2 fenilhidrazin  --> osazon + aniline + NH3 +H2O

Reaksi hanya menyangkut karbon karbonil (yaitu gugus aldehida atau keton) dan karbon yang berdekatan. Osazon dari glukosa dan fruktosa memiiki struktur yang sama. Pada fruktosa mula-mula gugus keton-nya akan bereaksi dengan fenilhirazin. Maltosa dan laktosa masing-masing membentuk maltosazon dan laktosazon, sedangkan sukrosa tidak membentuk osazon. 

Percobaan:

1. 5 ml larutan glukosa ke dalam tabung reaksi
2. Tambahkan 10 tetes asam asetat glasial dan sedikit fenilhidrasin padat serta Na-asetat sebanyak dua kali jumlah fenilhidrasin, lalu dipanaskan
3. Saring dan pindahkan pada tabung reaksi yang bersih kemudian masukkan ke dalam penangas air selam 30 menit
4. Dinginkan yang kemudian akan nampak endapan bewarna kuning
5. Amati endapan kuning tersebut di bawah mikroskop
6. Periksa kristal dan gambar bentuk kristal.